Рентгеновский лазер: описание, устройство, принцип работы
Вам будет интересно: В чем заключается приоритет образования в современных реалиях?
Ядра в структуре механизма
Так как обычные лазерные переходы между видимыми и электронными или колебательными состояниями соответствуют энергиям до 10 эВ, для рентгеновских лазеров необходимы различные активные среды. Опять же, для этого можно использовать различные активные заряженные ядра.
Оружие
В период с 1978 по 1988 год в проекте Excalibur военные США попытались разработать рентгеновский лазер с ядерным взрывным устройством для противоракетной обороны в рамках Стратегической оборонной инициативы «Звездные войны» (SDI). Проект, однако, оказался слишком дорогостоящим, затянулся и в итоге был заморожен.
Плазменные среды внутри лазера
Вам будет интересно: Боковая поверхность конуса: площадь как найти?
Наиболее часто используемые среды включают высокоионизованную плазму, созданную в капиллярном разряде, или когда линейно сфокусированный оптический импульс попадает в сплошную мишень. В соответствии с уравнением ионизации Саха, наиболее устойчивые электронные конфигурации неоновые, с оставшимися 10 электронами, и никелеподобные с 28 электронами. Переходы электронов в высокоионизованной плазме обычно соответствуют энергиям порядка сотен электрон-вольт (эВ).
Альтернативной усиливающей средой является релятивистский электронный пучок рентгеновского лазера на свободных электронах, который использует вынужденное комптоновское рассеяние вместо стандартного излучения.
Применение
Вам будет интересно: Пятерка популярных самарских университетов
Облегченная версия лазера может использоваться для аблятивного лазерного движения.
Рентгеновский лазер: как устроен
Как работают лазеры? Благодаря тому, что фотон попадает в атом с определенной энергией, вы можете заставить атом излучать фотон с этой энергией в процессе, называемом стимулированным излучением. Повторяя этот процесс в больших масштабах, вы получите цепную реакцию, которая приводит к лазеру. Однако некоторые квантовые узлы заставляют этот процесс останавливаться, поскольку фотон иногда поглощается без излучения вообще. Но чтобы обеспечить максимальные шансы, уровни энергии фотонов увеличиваются, а зеркала помещаются параллельно световому пути, чтобы помочь рассеянным фотонам вернуться в игру. И при высоких энергиях рентгеновских лучей обнаруживаются особые физические законы, свойственные именно этому явлению.
История
В начале 1970-х годов рентгеновский лазер казался вне досягаемости, поскольку большинство лазеров того времени достигало пика на 110 нм, что значительно меньше, чем у самых крупных рентгеновских лучей. Это было связано с тем, что количество энергии, необходимое для получения стимулированного материала, было настолько высоким, что ее нужно было доставлять быстрым импульсом, что еще больше усложняло способность к отражению, необходимую для создания мощного лазера. Поэтому ученые посматривали на плазму, поскольку она выглядела неплохой проводящей средой. Команда ученых в 1972 году заявила, что наконец добилась использования плазмы в создании лазеров, но когда они попытались воспроизвести ранее полученные результаты, у них по какой-то причине ничего не вышло.
Вам будет интересно: Что значит «курва» для поляка, а что – для древних римлян?
Проект «Звездные войны»
В выпуске журнала «Авиационная неделя и космическая техника» от 23 февраля 1981 года изложены результаты первых испытаний проекта, включая лазерный луч, импульсная волна которого доходила до 1,4 нанометров и поражала 50 различных целей.
Испытания от 26 марта 1983 года ничего не дали из-за отказа датчика. Однако следующие испытания от 16 декабря 1983 года продемонстрировали его подлинные возможности.
Дальнейшая судьба проекта
Хагельштейн предполагал двухступенчатый процесс, при котором лазер создавал плазму, которая высвобождала бы заряженные фотоны, сталкивающиеся с электронами другого материала и вызывающие выброс рентгеновских лучей. Было опробовано несколько установок, но в конечном итоге манипуляция ионами стала самым верным решением. Плазма удаляла электроны, пока не осталось только 10 внутренних, где фотоны затем заряжали их до состояния 3р, таким образом освобождая «мягкий» луч. Эксперимент 13 июля 1984 года доказал, что это было больше, чем теория, когда спектрометр измерял сильные выбросы на 20,6 и 20,9 нанометрах селена (неоноподобного иона). Тогда и появился первый лабораторный (не военный) рентгеновский лазер с именем Новетт.
Судьба «Новетт»
Другое применение и особенности функционирования
Итак, для чего можно использовать этот лазер? Ранее было замечено, что более короткая длина волны может облегчить исследование некоторых материалов, но это не единственная область применения. Когда цель поражается импульсом, ее просто уничтожает на атомные частицы, причем температура при этом достигает миллионов градусов всего за триллионную долю секунды. И если этой температуры хватит, лазер заставит электроны отслаиваться изнутри. Это связано с тем, что самый низкий уровень электронных орбиталей подразумевает наличие по меньшей мере двух электронов, которые выбрасываются из энергии, порождаемой рентгеновским излучением.
Время, затрачиваемое на то, чтобы атом потерял все свои электроны, составляет порядка нескольких фемтосекунд. Результирующее ядро не задерживается надолго и быстро переходит в плазменное состояние, известное как «теплое плотное вещество», которое в основном встречается в ядерных реакторах и ядрах крупных планет. Проводя эксперименты с лазером, мы можем получить представление об обоих процессах, представляющих собой различные формы ядерного синтеза.
Применение рентгеновского лазера воистину универсально. Еще одним полезным свойством этих рентгеновских лучей является их применение с синхротронами или частицами, ускоряющимися по всему пути ускорителя. Основываясь на том, сколько энергии требуется для этого пути, частицы могут излучать радиацию. Например, электроны при возбуждении выделяют рентгеновские лучи, которые имеют длину волны около размера атома. Тогда мы могли бы изучить свойства этих атомов через взаимодействие с рентгеновскими лучами. Кроме того, мы можем изменить энергию электронов и получить разные длины волн рентгеновских лучей, добиваясь большей глубины анализа.
Тем не менее, создать рентгеновский лазер своими руками очень сложно. Его структура крайне сложна даже с точки зрения опытных физиков.
В биологии
Вам будет интересно: Что такое тетива: описание, виды, характеристики
Даже биологи смогли извлечь пользу из рентгеновских лазеров (с ядерной накачкой). Их излучения могут помочь выявить аспекты фотосинтеза, ранее неизвестные науке. Они фиксируют тонкие изменения в листьях растений. Длинные волны мягких рентгеновских лучей лазера позволяют исследовать без разрушения все, что происходит внутри растения. Инъектор нанокристалла запускает фотоэлемент I, белковый ключ к фотосинтезу, необходимый для его активации. Это перехватывается лазерным лучом рентгеновских лучей, который заставляет кристалл буквально взорваться.
В случае дальнейшего успеха вышеупомянутых опытов, люди смогут разгадать тайны природы, и искусственный фотосинтез может стать реальностью. Также встанет вопрос о возможности более эффективного использования солнечной энергии, спровоцировав появление научных проектов на долгие годы вперед.
Магниты
Как насчет электронного магнита? Ученые обнаружили, что когда у них были атомы ксенона и молекулы, ограниченные иодом, ударяемые рентгеновским снимком высокой мощности, атомы отбрасывали свои внутренние электроны, создавая пустоту между ядром и самыми удаленными электронами. Силы притяжения приводили эти электроны в движение. Обычно этого не должно происходить, но из-за внезапности отпадения электронов происходит чрезмерно «заряженная» ситуация на атомном уровне. Ученые думают, что лазеру можно найти применение в обработке изображений.
Гигантский рентгеновский лазер Xfel
Расположенный в Национальной лаборатории ускорителей США, в частности на линейном ускорителе, этот 3500-футовый лазер использует несколько гениальных устройств для поражения целей с помощью жестких рентгеновских лучей. Вот некоторые из компонентов одного из самых мощных лазеров (аббревиатуры и англицизмы обозначают компоненты механизма):
В общем, структура этого механизма похожа на европейский рентгеновский лазер на свободных электронах.
Рентгеновский лазер
Рис.1,Получение рентгеновских лазерных лучей
Рентгеновский лазер или свободно-электронный лазер FEL (От англ. Free electron laser — свободно-электронный лазер ) — один из перспективных многих лазеров, в основе которого лежит электромагнитное излучение, состоящее из электромагнитных волн, которые могут достигать высокой энергии, но использующий разные операционные настройки для формирования луча. В отличие от газовых, жидкостных или лазеров твердого тела, типа диодных лазеров, где электроны возбуждаются в связанных атомных или молекулярных состояниях — у FELs (см.Рис.1) источником излучения является пучок свободных электронов, проходящий сквозь ряд расположенных специальным образом магнитов (ондулятор) и заставляющий их двигаться по синусоидальной траектории. Разгон электронов до околосветовых скоростей приводит к испусканию фотонов — синхротронному излучению.
Свободно-электронный лазер имеет самый широкий частотный диапазон любого лазерного типа, и может быть широко настраиваемым. В настоящее время этот диапазон настраивается в длинах волны от микроволновых печей, с частотой от ИК-излучения (к видимому спектру, к ультрафиолетовому) до Х-излучения. Французские и японские ученые изготовили лазер на свободных электронах с уменьшенным размером и способного создавать когерентное рентгеновское излучение с длиной волны до 32 нанометров. [1] [2]
Содержание
История рентгеновского лазера
Рентгеновский лазер с возбуждением активной среды с помощью энергии ядерного взрыва является на сегодняшний день одним из наиболее эффективных лазерных устройств дискретного применения. В лазерных рентгеновских микроскопах генерируется лазерный рентгеновский луч, обеспечивающий получение изображений с разрешением в 1,61 мкм.
Но при создании коротковолновых лазеров необходимо преодолеть принципиальные трудности. Чтобы осуществлялся эффект усиления электромагнитного излучения при его прохождении через активную среду, необходимо, во-первых, большое количество возбужденных атомов, готовых испустить кванты вынужденного излучения, а во-вторых, большая вероятность взаимодействия между квантами и этими атомами, обеспечивающая это вынужденное излучение. Коэффициент усиления излучения составляет:K = s (Nвоз – Nосн),где s – сечение взаимодействия квантов с атомами, Nвоз и Nосн – число атомов в возбужденном и основном состояниях. В условиях термодинамического равновесия Nвоз Nосн. Кроме этого, из фундаментальных законов квантовой физики следует, что s = 12 зм.
Для поддержки инверсной заселенности верхних уровней мощность возбуждения должна быть намного больше той, которая рассеивается в виде спонтанного излучения в среде(тепловые потери и др). Как известно, энергия кванта пропорциональна частоте излучения и к тому же вероятность спонтанного излучения, бесполезно уносящего энергию внешнего источника возбуждения, пропорциональна третьей степени от частоты излучения. Учитывая это, получим, что мощность, необходимая для поддержания инверсной заселенности, W µ n4 µ l–4.Так например для лазеров видимого диапазона с длиной волны около 500 нм, достаточно обеспечить мощность, вводимую в см 3 среды около 100–10000 Вт/см 3 (лампы-вспышки,хим-е реакции), то для лазера рентгеновского диапазона с длиной волны около 0,5 нм, плотность энергии «накачки» должна быть около 10 10 – 10 15 Вт/см2(!). Такой высокий уровень энергий при «накачке» может быть обеспечен только с помощью ядерного взрыва, либо в фокальном пятне мощного импульсного лазера.
После взрыва ядерного заряда вещество рабочих стержней превращается в полностью ионизованную плазму. Когда температура электронов несколько снижается, и начинается рекомбинация в основном на нижние уровни, происходит излучение в рентгеновской части спектра. Поскольку время высвечивания плазмы измеряется пикосекундами, и облако раскаленной до миллионов градусов плазмы не успевает существенно изменить свою геометрию, то оно сохраняет форму и направление рабочего стержня. Так как зеркал для работы с рентгеновским излучением с длиной волны около 10 A пока еще не существует (см.рентгеновское зеркало), то рентгеновский лазер, вероятно, должен работать без резонатора. Поэтому расходимость пучка будет определяться двумя факторами: дифракцией и геометрией стержня. Точнее говоря, наибольшим значением из них. Принимая малое значение расходимости, получим оптимальную величину диаметра: D = (lL)1/2. Для длин волн около 10-14 Aнгстрем и L = 7 м это дает D = 0,1 мм. Даже если в процессе ионизации и рекомбинации вещества его геометрия изменится незначительно, расходимость луча достигает
10 10 Джоулей. При КПД лазера около 8-10% и при расстоянии стержня от ядерного заряда
1 м мощность заряда должна быть около 10 15 Джоулей, или порядка двухсот килотонн тротилового эквивалента. При этом предположительно львиная доля энергии ядерного взрыва пойдет на испарение рабочих стержней(стержня), и сама струна ориентирована к заряду не торцом, а боковой поверхностью. Однако в литературе на эту тему упоминаются заряды значительно меньшей мощности. Возможно использовать не одну, а несколько десятков(около 50-100) параллельно ориентированных стержней наводимых на цель. Возможно также что инженеры попытаются создать концентратор энергии взрыва на одной струне, используя эффект отражения рентгеновских лучей от кристаллов или многослойные рентгеновские зеркала(с высокими характеристиками отражения), и в этой области предвидится значительный успех.
Современные технологии позволяют создавать относительно компактные рентгеновские лазеры(массой около 1-2 тонны) спецназначения с большим диапазоном регулировки мощности и величины длины волны, настольные, которые находят применение во многих областях:
Получение рентгеновского лазерного излучения
Акселераторы
Применение
Лазерный рентгеновский микроскоп
Рис.2, Принципиальная схема работы Лазерного рентгеновского микроскопа
Рентгеновский лазер как устроен
Рентгеновские лазеры
Особую роль в планах «звездных войн» играет проект рентгеновского лазера с накачкой энергией от ядерного взрыва. Вообще идея рентгеновских и гамма-лазеров давно привлекает внимание ученых. Применение таких лазеров даст человечеству большие возможности: как источники когерентных волн они приведут к рождению рентгеновской или гамма-голографии (молекулярной голографии), позволят расшифровать объемную структуру молекул и атомов. Возможность воздействовать на атомы и их ядра строго дозированными порциями энергии — квантами — позволит изучать и направленным образом изменять структуру атомных ядер. Тщательно подобрав частоту излучения, можно раскачивать и разрывать определенные связи в ядре и осуществлять таким образом самые экзотические ядерные превращения. Ту роль, которую играют сейчас оптические лазеры в области управления химическими реакциями, рентгеновские и гамма-лазеры будут играть в сфере ядерных превращений. Впрочем, они найдут применение и в хирургии, и в спутниковой связи, и в других областях народного хозяйства. Поэтому уже более 20 лет продолжаются попытки создать рентгеновский лазер, используя, разумеется, не разрушительную энергию ядерного взрыва, а контролируемые источники (например, обычные оптические лазеры).
В фокусе лазера помещалась мишень — тончайшая пленка размером 0,1 х 1,1 см из селена или иттрия. Луч испарял мишень, создавая плазму из ионов этих металлов. Столкновения с электронами в плазме вызывали возбуждение ионов, которое приводило к вынужденному излучению на частотах около 200 ангстрем. Наличие лазерного эффекта подтверждалось тем, что излучение, скажем, селеновой плазмы по интенсивности превышало примерно в 700 раз ожидаемое ее спонтанное излучение. По сообщению специалистов Ливерморской группы, планируется дальнейшее продвижение в область жесткого рентгена: так, излучение неоноподобных ионов молибдена даст лазерный эффект на 100 ангстрем, а использование новых лазеров накачки позволит уменьшить длину волны излучения до 50 ангстрем.
В 1986 г., полностью ионизировав в фокусе мощного лазера атомы фтора, исследователи получили лазерное излучение с длиной волны 80 ангстрем.
Результаты эксперимента, в ходе которого списанная ракета-носитель «Титан» была уничтожена лучом лазера
Фемтосекундные рентгеновские лазеры — кристаллография будущего
Фемтосекундные рентгеновские лазеры — кристаллография будущего
Автор
Редактор
Метод рентгеноструктурного анализа до сих пор является «золотым стандартом» в исследовании пространственной организации биополимеров, в частности белков. Несмотря на это, он не лишен существенных недостатков и ограничений: необходимые кристаллы трудно получать, кристаллизуемые молекулы обычно помещают в условия, далекие от таковых в клетке (температура, ионная сила и т. п.), получаемая структура зачастую является «средним по палате», а информация о подвижности молекул и вовсе напрямую недоступна. Однако новые фемтосекундные рентгеновские лазеры сулят истинный переворот в области структурной биологии. Возможно, в скором будущем кристаллизовать и вовсе не придется, а исследователи будут снимать «кино» про единичные молекулы с атомарным разрешением.
Нет сомнений, что белки — молекулы, определяющие жизнь. С помощью белковых каналов в нервных клетках мы думаем, с помощью белковых ферментов перевариваем пищу, с помощью белков-антител защищаемся. Но белок работает на нас только тогда, когда правильно сложен, то есть приобрел правильную конформацию, укладку. А какая она, правильная? Вновь синтезированный белок — как квадрат белой бумаги для оригами: можно сложить кораблик, а можно журавля. Конечно, выбор ограничен, но огромен, даже если известна длина белка и все входящие в его состав аминокислоты (в нашей аналогии — размер квадрата бумаги).
Знание структуры белка необходимо в первую очередь для медицинских разработок, особенно для подбора эффективных лекарств — драг-дизайна [1]. Если разработчики будут знать точное место белка-мишени, на которое действует активный компонент лекарства, это и удешевит драг-дизайн (а значит, снизит стоимость лекарства), и — с большой вероятностью — устранит побочные эффекты.
На фоне этой необходимости родилось новое направление биологии — структурная геномика, которая, комбинируя компьютерное моделирование и экспериментальные подходы, ставит амбициозные цели определить структуры всех белков, кодируемых данным геномом*. За 15 лет существования программа по структурным исследованиям белков (PSI — Protein Structure Initiative) автоматизировала систему кристаллизации и анализа, охарактеризовала около 7000 белков, но породила некоторые споры [2]. Дело в том, что охарактеризованные белки большей частью бактериальные, функции их не всегда известны, и подходят они разве что для «соревнований» компьютерных программ предсказания белковых структур по последовательности аминокислот (I-TASSER и Rosetta), но не для целей драг-дизайна [3].
* — В структурной геномике для изучения строения белков часто применяют метод рентгеноструктурного анализа. Он основан на взаимодействии рентгеновского излучения с молекулами, пространственную структуру которых необходимо определить. При падении на объект рентгеновских лучей может происходить их поглощение, отражение или дифракция. Дифракция в данном случае — это рассеяние рентгеновских лучей молекулами вещества, при котором из начального пучка лучей возникают вторичные отклонённые пучки той же длины волны. Картина такого рассеяния рентгеновских лучей, зафиксированная на светочувствительном материале, — рентгенограмма — дает исследователям информацию о строении изучаемой молекулы. Подробнее о структурной геномике «биомолекула» рассказывала в статье «Ловля бабочек, или чем структурная геномика поможет биологии» [4]. — Ред.
Однако основное возражение куда более конструктивно, чем «вы определяете структуру не тех белков» (попробуйте, определите структуру «тех»). А такая ли в клетке, in vivo, структура белка, как вы определили? Это указывает на слабое место современной структурной биологии. Главный физический метод, которым она оперирует, — рентгеноструктурный анализ — работает с кристаллами, а при кристаллизации белок может сложиться не так, как в клетке. Кроме того, кристалл не может показать конформационных изменений, происходящих при модификации белка или взаимодействии фермента с субстратом, не говоря уже о том, что мембранные белки — рецепторы и каналы (как раз первые цели лекарств) — вообще плохо кристаллизуются. Однако луч света — яркого света лазеров на свободных электронах — уже забрезжил в темном царстве.
1. РЛСЭ в структурной биологии
Недавние разработки в области рентгеновских лазеров на свободных электронах (РЛСЭ, XFEL, X-Ray Free-Electron Laser) открывают совершенно новые возможности для структурной биологии. Еще в конце прошлого столетия невозможно было поверить, что появится возможность получать изображения единичной молекулы, используя рассеяние электромагнитного излучения, поскольку необходимые для наблюдения высокоуглового упругого рассеяния дозы излучения попросту разрушат исследуемый объект [5]. Позднее было высказано предположение, что использование кратковременных импульсов позволит избежать разрушений [6]. Если в исследовании применить «мгновенный» и сверхинтенсивный рентгеновский пучок, то картину упругого рассеяния без искажений от разрушения объекта можно будет получить вне зависимости от дозы излучения, разрешения и размера образца — вплоть до уровня единичной молекулы. Фактически молекула «расскажет» о себе всё, еще не успев разрушиться. А там — будь что будет.
Современные эксперименты показали, что, если доза излучения передается за короткое время, действительно можно получить картину рассеяния без следов разрушения [7]. В данном случае рассеяние происходит быстрее, чем последующее разрушение образца, что дает возможность получать «молекулярные снимки» в режиме «рассеяние-до-разрушения». Однако неизбежное разрушение объекта после прохождения луча требует постоянного обновления образца — подбора частиц с идентичными характеристиками: молекул белка и их олигомеров, вирусов и т.д. Достичь атомного разрешения при использовании методики «рассеяние-до-разрушения» возможно только с помощью когерентного суммирования Брэгговского рассеяния от нанокристаллов.
Если «молекулярные снимки» получены для множества случайных ориентаций и молекула имеет предположительно ограниченное число конформаций, то появляется возможность отсортировать полученные данные и объединить их в трехмерное «молекулярное кино». При этом, как было показано в вычислительных экспериментах [8], для реконструкции требуется, чтобы конформационные и ориентационные изменения можно было различить.
1.1. Принцип работы систем с использованием РЛСЭ (физика)
На сегодняшний день уже очевидно, что только технические характеристики РЛСЭ и инжекторов образцов (яркость, диаметр пучка, частота повторения импульсов, коэффициент попадания, фоновые эффекты от растворителя и т.д.) ограничивают получение картины рассеяния на уровне единичных молекул.
Рассмотрим физические основы метода РЛСЭ. Для получения лазерного луча (рис. 1), «несущего» необходимое когерентное излучение, используется пучок электронов, разогнанных на линейном ускорителе до скорости, близкой к скорости света (u ≈ c). Эмиссия и усиление электромагнитных волн происходит в системе, состоящей из массива магнитов, поочередно меняющих свою полярность (ондулятор) с периодом L. Периодическое магнитное поле B ондулятора описывается формулой:
Электроны, попадая в такое магнитное поле, начинают осциллировать с поперечной скоростью (vt), что приводит к испусканию ими электромагнитных волн. В отличие от обычного ондулятора, в РЛСЭ электроны испускают скоррелированные электромагнитные волны*.
Рисунок 1. Схема работы рентгеновского лазера на свободных электронах. 1. Источник и ускоритель электронов. 2. Система магнитов (ондулятор). 3. Ловушка для электронов. 4. Рентгеновский луч. Траектория движения электронов показана красной синусоидой. Пучок электронов из ускорителя (1) на высокой скорости попадает в периодическое магнитное поле, создаваемое ондулятором (2), и сам начинает испускать скоррелированные электромагнитные волны каждые 10–200 фс (4). После создания лазерного рентгеновского пучка электроны удаляются улавливателем электронов (3). Рисунки из [9] и [10], адаптированы.
* — В таком магнитном поле на электрон, движущийся со скоростью vt, действует сила Лоренца, собирающая электроны в микропучок с периодом, равным длине испущенной волны. В результате электроны в пучке под действием ондулятора осциллируют синхронно, и их излучение становится скоррелированным, что также приводит к возрастанию интенсивности полученного рентгеновского луча [9, 10].
При использовании РЛСЭ в структурной биологии необходимо знать, что длина импульса излучения обычно составляет 10–200 фс (фемтосекунд), а мощность — примерно 5 МДж. Это соответствует пиковой рентгеновской мощности вплоть до 50 ГВт. При энергии фотонов 8 кЭВ данный импульс несет 4 × 10 12 фотонов (или 6 × 10 13 — при энергии 500 ЭВ). При этом эффективность передачи излучения от источника к образцу составляет 20%. Импульсы практически полностью когерентны и монохроматичны, разброс в диапазоне частот составляет
0,1% (хотя длина волны от импульса к импульсу может варьировать в пределах 0,3%).
На рисунке 2 показана общая схема* установки, используемой в ранних работах по белковой нанокристаллографии в Стэнфорде.
Рисунок 2. Схема стэнфордской установки LCLS для фемтосекундной нанокристаллографии. Частицы образца распыляются в вакууме газодинамическим распылителем. Рентгеновское излучение проходит перпендикулярно сквозь полученную струю. Дифракционная картина регистрируется детектором. Возбуждение образца возможно с помощью дополнительного оптического лазера-помпы. Левый рисунок из [11], правый — с сайта desy.cfel.de.
* — Согласно этой схеме, нанокристаллы изучаемых молекул распыляются в направлении, перпендикулярном рентгеновскому лучу, и дифракционные картины считываются на разделенном детекторе после каждого импульса, который в описываемом примере имеет частоту 120 Гц. Такой способ регистрации позволяет записывать данные одновременно для больших (низкое угловое разрешение) и малых (высокое угловое разрешение) углов. Поскольку ловушка может разрушаться под действием рентгеновского луча, в детекторе необходимо предусмотреть щель, позволяющую свободно проходить нерассеянному пучку после малоуглового рассеяния и затухать далее. Второй детектор (не показан на схеме), также разделенный на две панели, размещается позади первого для регистрации малоуглового рассеяния. Расстояние между первым детектором и образцом, подвергающимся воздействию рентгеновского луча, здесь составляет 10 см [11].
В зависимости от типа исследуемого объекта (например, нанокристаллы белков, вирусные частицы, паста, содержащая мембранные белки и липиды в кубической или губчатой фазе) может варьировать система доставки образца: обычно это струя жидкости или газа с возможным охлаждением. Для нанокристаллов белков подходит доставка в струе жидкости, потому что интенсивность брэгговских пиков от нанокристалла намного выше, чем от окружающего растворителя (воды). Обычно диаметр такой струи составляет несколько микрон (минимум 0,3 мкм) [12]. Кроме того, такие исследования можно проводить при комнатной температуре, что тоже выгодно отличает нанокристаллографию от ее «обычной» разновидности.
На сегодняшний день были апробированы различные варианты стандартных схем доставки. Например, смешивание нескольких растворов, содержащих фермент и субстрат, в инжекторе [13] позволяет получать временны́е серии рентгеновских снимков, отражающих протекание реакции. А использование инжекторов для жидкостей с повышенной вязкостью (как у зубной пасты) сильно облегчает изучение мембранных белков в липидном окружении [14]. Также была показана возможность формирования текучих бислойных плёнок, пересекающих рентгеновский пучок и обеспечивающих постоянный поток мембранных белков, таких как G-белоксопряженные рецепторы [15], ионные каналы [16] или даже двумерные белковые кристаллы [17].
Высокий расход белкового материала, характерный для ранних экспериментов, можно уменьшить, изменяя характеристики РЛСЭ. Чтобы получать больше данных от меньшего количества образца, можно, например, увеличить частотный диапазон излучения (c 0,1% до 2%), что планируется реализовать в швейцарской установке РЛСЭ (SwissFEL), или в сотни раз повысить частоты повторения импульсов, что заявлено для Европейского РЛСЭ в Гамбурге (European XFEL). Позволяют оптимизировать необходимое количество биологического образца и свойства инжектора: скорость протекания жидкости, ее вязкость и пр.
1.2. Характеристика установки РЛСЭ в Стэнфорде (LCLS)
Первым работающим РЛСЭ стал LCLS (Linac Coherent Light Source; параметры см. в таблице 1), расположенный неподалеку от Стэнфорда (Калифорния, США) и использующий для получения пучка разогнанных электронов Стэнфордский линейный ускоритель длиной 3 км. LCLS запустили в национальной ускорительной лаборатории SLAC в 2009 году, и все основные работы по белковой фемтосекундной кристаллографии были проведены именно на нём. Среди них следует выделить изучение структуры фотосистемы I (мембранного белкового комплекса растений, участвующего в процессе фотосинтеза) с низким,
8 Å, разрешением [18], изучение единичного вириона мимивируса [19] и получение структуры белка (лизоцима) с разрешением 2 Å [20] (подробнее — в соответствующих разделах). Лаборатория активно сотрудничает с Аргоннской и Ливерморской национальными лабораториями США, Институтом Макса Планка (Германия) и многими другими учреждениями по всему миру.
При финансировании Министерством энергетики Соединенных Штатов планируется модификация установки до LCLS-II с частотой миллион импульсов в секунду (10 6 Гц). Подобная модификация позволит изучить прежде недосягаемые явления в химическом катализе и фотокатализе, изменение структуры биологических объектов в реальном времени, состояние материи в экстремальных условиях, динамику энергии, заряда и материи.
| LCLS | SACLA | European XFEL | |
|---|---|---|---|
| Аббревиатура от. | Linac Coherent Light Source | The SPring-8 Angstrom Compact Free Electron Laser | European X-Ray Free-Electron Laser |
| Местонахождение | Калифорния, США | Япония | Германия |
| Ввод в эксплуатацию | 2009 | 2011 | 2017 |
| Частота РЛСЭ, Гц | 120 | 60 | 27 000 |
| Минимальная длина волны, Å | 1,5 | 0,8 | 0,5 |
| Длина ускорителя, км | 3 | 0,7 | 3,4 |
| Число ондуляторов | 1 | 3 | 5 |
| Число экспериментальных станций | 3–5 | 4 | 6, с возможностью увеличения до 10 |
| Пиковая светимость [фотоны / с / мм 2 / мрад 2 / 0,1% частоты] | 2 × 10 33 | 1 × 10 33 | 5 × 10 33 |
| Средняя светимость [фотоны / сек / мм 2 / мрад 2 / 0,1% частоты] | 2,4 × 10 22 | 1,5 × 10 23 | 1,6 × 10 25 |
1.3. Характеристика установки РЛСЭ в Японии (SACLA)
Через 2 года после успеха cтэнфордской установки в Японии расцвела «САКУРА» (именно так следует произносить аббревиатуру SACLA: The SPring-8 Angstrom Compact Free Electron Laser). Отличительной чертой установки является малая длина ускорителя (0,7 км), но при этом достигается субангстремное разрешение — 0,6 Å. Интересный факт: компания SPring-8 выпустила научно-популярные аниме, объясняющие широкой публике возможности прибора.
1.4. Характеристики строящейся установки РЛСЭ в Гамбурге (European XEFL)
С 2009 года в Гамбурге (Германия) ведется строительство нового центра РЛСЭ (European XEFL). Плановое окончание работ предусмотрено в 2016 году, а первый эксперимент — в 2017. Для создания электронного пучка будет использован ускоритель длиной 3,4 км, расположенный между Шенефельдом и Гамбургом. Основным отличием European XEFL от LCLS станет использование эффекта сверхпроводимости при −271 °С в электронном ускорителе. Сверхпроводимость позволяет создавать электронные пучки повышенного качества. В результате частота рентгеновских импульсов будет в несколько сотен раз выше (27 кГц), чем у LCLS (табл. 1), что значительно увеличит объем получаемых в единицу времени кристаллографических данных, позволит использовать меньшие количества образца, более скоростные инжекторы и т.д.
В целом, многие эксперименты, которые ранее проводились на LCLS, на European XFEL будут выполняться значительно быстрее, а также появится возможность проводить исследования, «неподдающиеся» LCLS. Большее число генерируемых электронных пучков позволит создать больше одновременно работающих экспериментальных станций.
Проект European XEFL реализуется международной командой, в состав которой вошли более 200 исследователей и инженеров из 12 стран. Германия и Россия предоставили 54 и 23% от общего объема финансирования соответственно, что дает этим странам преимущественные права использования установки.
1.5. Основные отличия последовательной фемтосекундной кристаллографии с использованием РЛСЭ от классического рентгеноструктурного анализа
Разрешение и «качество» классического рентгеноструктурного анализа (РСА) обычно ограничены качеством исследуемого кристалла и эффектом от его разрушения под действием рентгеновского излучения. Поэтому ключевым моментом для РСА макромолекул является подготовка большого, хорошо дифрагирующего кристалла. На подбор условий кристаллизации разных биомолекул (например, белков) могут уходить годы.
Обычно РСА проводят в низкотемпературных (крио-) условиях, что, с одной стороны, повышает стабильность кристалла, а с другой — ограничивает конформационное разнообразие изучаемой молекулы. Недавние исследования белков с помощью РСА при комнатной температуре показали, что охлаждение приводит к преобладанию «вымороженной» конформации молекулы, в которой зачастую до 35% боковых групп аминокислотных остатков может иметь не такую упаковку, как при комнатной температуре. Это, в свою очередь, может играть критическую роль в изучении аллостерических эффектов связывания лигандов с белком [21]. Многие из перечисленных проблем можно решить с помощью последовательной фемтосекундной кристаллографии (ПФК) с использованием РЛСЭ.
Так, в ПФК нет необходимости растить крупные кристаллы: размер используемых нанокристаллов обычно составляет десятые или даже сотые доли микрона (при этом кристалл содержит всего несколько элементарных ячеек). Можно получать дифракционные картины вообще от единичных биочастиц (например, вирусов). ПФК-исследования обычно проводятся при комнатной температуре, и образец находится в условиях, близких к нативным (водные растворы, липиды в различном фазовом состоянии).
Качество кристалла и его вероятное повреждение под действием излучения практически перестают играть роль. Кроме того, появляется возможность получать данные о конформационных изменениях белковых молекул в ходе различных биохимических процессов. Уже были проведены пробные исследования фотосистемы I в связанном с ферредоксином состоянии, где сравнивали дифракцию от комплекса в темновой фазе и возбужденном (с помощью лазерной помпы) состоянии [22].
Тем не менее стоит отметить, что характер дифракционных картин, получаемых в ПФК (рис. 3а), отличается от таковых при классическом РСА (рис. 3б).
Рисунок 3. Сравнение дифракционных картин, полученных в ходе ПФК и РСА. а — Картина, полученная от одного 40-фс импульса РЛСЭ для единичного нанокристалла фотосистемы I в жидкой струе. Полоса в центре соответствует дифракции от непрерывного столба жидкости. По числу дополнительных минимумов можно определить, что кристалл содержит 17 элементарных ячеек. б — Дифракционный портрет белка, полученный методом рентгеноструктурного анализа на ускорителе HASYLAB/DESY в Германии. Фото: HASYLAB/DESY, Max Planck working groups, Hamburg. Рисунки из [11] и с сайта www.vokrugsveta.ru.
При исследовании субмикронных кристаллов с помощью РЛСЭ дифракционные снимки содержат неполные Брэгговские рефлексы, в отличие от дифракционной картины, получаемой на синхротроне, где непрерывное вращение кристалла обеспечивает угловое интегрирование, необходимое для определения структурных факторов. Для решения прямой кристаллографической задачи необходимо индексирование* и объединение миллионов дифракционных снимков, получаемых на LCLS с частотой 120 штук в секунду в течение многих дней, что в итоге генерирует терабайты информации. (Использование нового РЛСЭ в Гамбурге существенно ускорит подобные эксперименты.)
* — Естественно, процедуры индексирования должны быть полностью автоматическими — в отличие от РСА, где часто этот процесс можно проводить «вручную». При исследовании мельчайших нанокристаллов рассеяние может происходить в не-Брэгговских направлениях, что затрудняет процедуру автоматического индексирования получаемых пиков. В настоящий момент структурные факторы определяют интегрированием методом Монте-Карло всех неполных рефлексов, имеющих одинаковые Миллеровские индексы по всему объему полученных данных.
Как и в классическом РСА, серьезную проблему представляет двоение пиков. Даже если для индивидуального нанокристалла двоение не наблюдается, оно может возникнуть при объединении данных от различных нанокристаллов.
Несмотря на то, что проблема фазирования (сбора информации не только об интенсивности света, попадающего на исследуемый объект, но и о его фазе [23]) так же важна для ПФК, как и для классического РСА, появляются новые способы ее решения — в первую очередь в связи с использованием полностью когерентного рентгеновского пучка. Например, метод «избыточного сэмплирования» предполагает определение точного числа элементарных ячеек (рис. 3а) в нанокристаллах и/или объединение данных от многих кристаллов в 3D. Наконец, для ПФК возникает проблема эффективности попадания лазерного пучка в нанокристаллы, движущиеся в струе инжектора. Многие вспышки могут происходить «впустую» или же взаимодействовать с кристаллом «по касательной», что ведет к искажению дифракционных картин. Эффективность попадания также необходимо учитывать при реконструкции дифракционной картины от многих нанокристаллов.
Помимо исследования нанокристаллов, РЛСЭ позволяет получать дифракционные картины от произвольно ориентированных единичных биочастиц (например, вирусов). В данном случае задача объединения тысяч различных дифракционных снимков сходна с нахождением усредненной электронной плотности в методе криоэлектронной микроскопии.
1.6. Использование ПФК в исследовании мембранных белков
ПФК дает уникальные возможности в исследовании белков, с трудом поддающихся кристаллизации. Используемые нанокристаллы настолько малы, что обычно невидимы в оптический микроскоп. Этот метод позволяет изучать белки, которые при кристаллизации дают только россыпь нанокристаллов, формирующих аморфный осадок в растворе для кристаллизации. Возникает вопрос: как много нанокристаллов мембранных белков, которые можно использовать для исследований, уже имеется в различных лабораториях мира?
На сегодняшний день нанокристаллы можно регистрировать с помощью метода SONICC, который при систематическом скрининге позволит выявить более тысячи нанокристаллов различных мембранных белков (около 30% осадков, получаемых при кристаллизации, может содержать нанокристаллы) [24]. Таким образом, стоит ожидать, что в ближайшее время установление структуры мембранных белков может стать вполне рутинной процедурой.
2. Примеры биологических задач, решенных с помощью ПФК
2.1. Структура фотосистемы I
С помощью ПФК (на установке LCLS) недавно удалось получить структуру низкого разрешения (8,5 Å) одного из наиболее крупных комплексов мембранных белков — фотосистемы I (рис. 4) [18]. С использованием импульсов длительностью 70 фс получили около трех миллионов дифракционных картин, собранных с нанокристаллов размером 0,2–2 мкм. При этом все измерения проводились при комнатной температуре с подачей кристаллов в струе жидкости.
Рисунок 4. Структура фотосистемы I низкого разрешения (8,5 Å). Слева показана электронная плотность, полученная с помощью ПФК при комнатной температуре в струе жидкости, справа — полученная на синхротроне при температуре 100 К. Вписанная модель белкового комплекса показана желтым. Авторы утверждают, что на левом рисунке ясно видны электронно-плотные участки отдельных трансмембранных доменов и даже некоторые петлевые структуры. Действительно, сильно присмотревшись, можно заметить, что модель белкового комплекса вписывается в левую структуру «плотнее», чем в правую. То есть точность полученных методом ПФК структур выше. Рисунок из [18], адаптирован.
2.2. Исследование мимивирусов
С помощью ПФК можно получать дифракционные картины с единичных вирусных частиц и крупных макромолекул, находящихся в некристаллическом состоянии. Дифракционные картины высокого качества получили, например, для отдельной частицы мимивируса* на LCSL [19]. Несмотря на то, что после прохождения рентгеновского пучка вирусные частицы разрушались в результате нагревания до 10 5 K (переходили в плазменное состояние), удалось получить карты электронной плотности с разрешением 32 нм, которые показали гетерогенную организацию материала внутри вириона, а также его икосаэдрическую структуру (рис. 5). В исследовании использовали импульсы длительностью 70 фс и гидратированные вирусные частицы в виде аэрозоля. В дальнейшем можно достичь существенного повышения разрешения при уменьшении длительности импульса и области фокусировки и увеличении яркости пучка.
В 2015 году получили 3d-реконструкцию внутренней структуры мимивируса [27]. Исследователям удалось модифицировать алгоритм expand, maximize and compress (EMC) для правильного совмещения 198 полученных дифракционных картин. Это нетривиальная задача, поскольку каждая частица попадает под луч лазера в произвольной ориентации. Исследователи обнаружили асимметричность внутренней структуры вируса (рис. 5).
Рисунок 5. Исследование единичных вирионов мимивируса с помощью ПФК. а — 3d-реконструкция. Видна несимметричность «внутренностей» вируса. б — Проекция полученной электронной плотности. в — Срез через центр проекции. Рисунок из [27].
2.3. Структура лизоцима высокого разрешения
Наряду с получением структур низкого разрешения была показана возможность достижения атомного разрешения при использовании ПФК в исследованиях белковых кристаллов в струе жидкости при комнатной температуре. Так, для кристаллов лизоцима сравнительно небольших размеров (1 × 1 × 3 мкм 3 ) на LCLS с 40-фс импульсами были получены дифракционные картины с разрешением 2 Å (около 1,5 миллионов изображений). Они позволили реконструировать карту электронной плотности, практически не отличающуюся от полученной на синхротроне в ходе «классического» рентгеноструктурного анализа (рис. 6) [20].
Рисунок 6. Дифракционный снимок кристалла лизоцима. Картина получена с помощью единичного 40-фс импульса РЛСЭ для кристалла лизоцима в струе жидкости при комнатной температуре. Разрешение составляет 1,8 Å. Фоновое рассеяние от растворителя вычтено. Рисунок из [20].
Метод РЛСЭ пока не слишком широко известен из-за своей дороговизны и специфики, однако уже через 2–3 года появится третий в мире и первый в Европе центр, способный использовать такую технологию. В связи с высоким уровнем развития науки в Европе ожидается волна открытий структур важнейших белков и других биомолекул, не поддающихся кристаллизации. В конечном итоге станет возможным и создание «биокино», поэтапно показывающего жизнь одиночной молекулы или ее изменения в ходе какого-то процесса. РЛСЭ — будущее структурной биологии.
