Стереоизомеры
Содержание
Энантиомерия (оптическая изомерия)
Пространственная изомерия (стереоизомерия) возникает в результате различий в пространственной конфигурации молекул, имеющих одинаковое химическое строение. Этот тип изомеров подразделяют на энантиомерию (оптическую изомерию) и диастереомерию.
Энантиомерами (оптическими изомерами, зеркальными изомерами) являются пары оптических антиподов — веществ, характеризующихся противоположными по знаку и одинаковыми по величине вращениями плоскости поляризации света при идентичности всех других физических и химических свойств (за исключением реакций с др. оптически активными веществами и физических свойств в хиральной среде). Необходимая и достаточная причина возникновения оптических антиподов — принадлежность молекулы к одной из следующих точечных групп симметрии: Cn, Dn, T, O или I (хиральность). Чаще всего речь идет об асимметрическом атоме углерода, то есть об атоме, связанном с четырьмя разными заместителями.
Асимметрическими могут быть и другие атомы, например атомы кремния, азота, фосфора, серы. Наличие асимметрического атома — не единственная причина энантиомерии. Так, имеют оптические антиподы производные адамантана (IX), ферроцена (X), 1,3-дифенилаллена (XI), 6,6′-динитро-2,2′-дифеновой кислоты (XII). Причина оптической активности последнего соединения — атропоизомерия, то есть пространственная изомерия, вызванная отсутствием вращения вокруг простой связи. Энантиомерия также проявляется в спиральных конформациях белков, нуклеиновых кислот, в гексагелицене (XIII).
(R)-, (S)- номенклатура оптических изомеров (правило наименования)
Четырём группам, присоединенным к асимметрическому атому углерода Cabcd, приписывается различное старшинство, отвечающее последовательности: a>b>c>d. В простейшем случае, старшинство устанавливается по порядковому номеру атома, присоединенного к асимметрическому атому углерода: Br(35), Cl(17), S(16), O(8), N(7), C(6), H(1).
Например, в бромхлоруксусной кислоте:
Старшинство заместителей при асимметрическом атоме углерода следующее: Br(a), Cl(b), C группы COOH (c), H(d).
У бутанола-2 кислород является старшим заместителем (а), водород — младшим (d):
Требуется решить вопрос о заместителях —CH3 и —CH2CH3. В этом случае старшинство определяется порядковым номером или номерами других атомов в группе. Первенство остается за этильной группой, так как в ней первый атом С связан с другим атомом С(6) и с другими атомами Н(1), тогда как в метильной группе углерод соединен с тремя атомами Н с порядковым номером 1. В более сложных случаях продолжают сравнивать все атомы, пока не доходят до атомов с различными порядковыми номерами. Если имеются двойная или тройная связи, то находящиеся при них атомы считаются соответственно за два и за три атома. Так, группу —COH рассматривают как С (O, O, H), а группу —COOH — как С(О, О, ОН); карбоксильная группа старше альдегидной, поскольку содержит три атома с порядковым номером 8.
В D-глицериновом альдегиде старшей является группа ОН(а), затем следует CHO(b), CH2OH(c) и Н(d):
Следующий этап заключается в определении, является ли расположение групп правым, R (лат. rectus ), или левым, S ( sinister ). Переходя к соответствующей модели, её ориентируют так, чтобы младшая группа (d) в перспективной формуле оказалась внизу, и затем рассматривают сверху вдоль оси, проходящей через заштрихованную грань тетраэдра и группу (d). В D-глицериновом альдегиде группы
расположены в направлении правого вращения, и следовательно, он имеет R-конфигурацию:
В отличие от D-, L- номенклатуры, (R)- и (S)- в обозначении изомеров заключают в скобки.
Диастереомерия
σ—диастереомерия
Диастереомерными считают любые комбинации пространственных изомеров, не составляющие пару оптических антиподов. Различают σ и π-диастереомеры. σ-диастереомеры отличаются друг от друга конфигурацией части имеющихся в них элементов хиральности. Так, диастереомерами являются (+)-винная кислота и мезо-винная кислота, D-глюкоза и D-манноза, например:
Для некоторых типов диастереомерии введены специальные обозначения, например, трео- и эритро-изомерия — это диастереомерия с двумя асимметрическими атомами углерода и пространственным расположением заместителей у этих атомов, напоминающим соответствующую треозу (родственные заместители находятся по разные стороны в проекционных формулах Фишера) и эритрозу (заместители — по одну сторону):
Эритро-изомеры, у которых асимметрические атомы связаны с одинаковыми заместителями, называются мезо-формами. Они, в отличие от остальных σ-диастереомеров, оптически неактивны из-за внутримолекулярной компенсации вкладов во вращение плоскости поляризации света двух одинаковых асимметрических центров противоположной конфигурации.
Пары диастереомеров, различающиеся конфигурацией одного из нескольких асимметрических атомов, называются эпимерами, например:
Термин «аномеры» обозначает пару диастереомерных моносахаридов, различающихся конфигурацией гликозидного атома в циклической форме, например, аномерны α-D- и β-D-глюкозы.
π—диастереомерия (геометрическая изомерия)
π-диастереомеры, называемые также геометрическими изомерами, отличаются друг от друга различным пространственным расположением заместителей относительно плоскости двойной связи (чаще всего С=С и С=N) или цикла. К ним относятся, например, малеиновая и фумаровая кислоты (формулы XIV и XV соответственно), (Е)- и (Z)-бензальдоксимы (XVI и XVII), цис- и транс-1,2-диметилциклопентаны (XVIII и XIX).
Конформеры
Явление неразрывно связано с температурными условиями его наблюдения. Так, например, хлорциклогексан при комнатной температуре существует в виде равновесной смеси двух конформеров — с экваториальной и аксиальной ориентацией атома хлора:
Однако при −150 °C можно выделить индивидуальную а-форму, которая ведет себя в этих условиях как устойчивый изомер.
Изомеры, превращающиеся друг в друга при температуре ниже комнатной, можно рассматривать как нежесткие молекулы.
Изомерия также характерна для координационных соединений. Так, изомерны соединения, различающиеся по способу координации лигандов (ионизационная изомерия), например, изомерны:
Здесь, по существу, имеется аналогия со структурной изомерией органических соединений.
Таутомеры
С другой стороны, соединения, в обычных условиях являющиеся изомерами, при повышении температуры могут оказаться находящимися в равновесии таутомерами. Например, 1-бромпропан и 2-бромпропан — структурные изомеры, однако при повышении температуры до 250 °C между ними устанавливается равновесие, характерное для таутомеров.
Стереоизомерия
Изомерия – это явление, при котором вещества имеют одинаковый количественный, качественный состав, молекулярную массу, но отличаются химическим строением или пространственным расположением атомов или групп атомов в молекуле.
Изомерия делится на 2 вида: структурную и пространственную.
Структурная изомерия подразделяется:
3) изомерия положения функциональных групп. Пр.: CH3–CH2–CH2–OH – пропанол-1 и пропанол-2 (стер2);
Пространственная изомерия или стереоизомерия – это вид изомерии, при котором изомеры или стереоизомеры отличаются друг от друга пространственным расположением атомов или групп атомов в молекуле.
Стереоизомерия делится на следующие виды:
2) энантиомерия (оптическая изомерия);
3) диастереомерия (геометрическая изомерия). Она, в свою очередь, подразделяется на:
а) δ (сигма)-диастереомерию;
Энантиомерия возможна у любых органических соединений, содержащих асимметричный атом углерода.
Асимметричным называется атом углерода, соединенный с четырьмя различными группировками, например α-углеродный атом в молекуле молочной кислоты (стер3). Асимметричный атом углерода обозначается звездочкой (*).
Молекулы веществ, содержащих асимметричный атом углерода, называется хиральными, а асимметричный атом углерода называется хиральным центром.
Энантиомерия – это вид изомерии, при котором стереоизомеры, называемые энантиомерами относятся между собой как предмет и несовместимое с ним зеркальное изображение.
Пр.: пара энантиомеров молочной кислоты: (стер4)
Для обозначения внешней конфигурации энантиомеров вводится понятие о D и L – формах, т.е. устанавливают принадлежность каждого энантиомера к определенному D или L стереохимическому ряду.
В D-формах заместитель, соединенный с хиральным центром, записывается справа по отношению к углеродной цепи, а в L-форме – слева по отношению к углеродной цепи.
Энантиомеры обладают оптической активностью, они способны вращать плоскость поляризации света. Оптическая активность энантиомеров определяется на приборе поляриметре, в котором луч света, пройдя через специальную призму, колеблется к одной плоскости, становится плоскополяризованным. Энантиомеры способны отклонять такой луч либо влево, либо вправо [отклонения, (стер5)].
У энантиомеров угол вращения плоскости поляризации света одинаковый, но направление вращения противоположное. Один энантиомер – левовращающий (знак «-»), а другой – правовращающий (знак «+»). Напр.: у молочной кислоты D(-), α=-2,6°; L(+), α=+2,6° (при 22°С в 25% растворе).
Пары 1 и 3, 1 и 4, 2 и 3, 2 и 4 не являются энантиомерами. У них проявляется другой вид стереоизомерии – диастереомерия.
Диастереомеры – изомеры, которые не являются энантиомерами.
У вышеперечисленных пар стереоизомеров проявляется d-диастереомерия, т.к. заместители соединены с хиральными центрами d–связями. Стереоизомер, у которого заместители, соединенные с хиральными центрами, располагаютя по одну сторону от углеродной цепи называется эритроформа, а по разные стороны – треоформа.
У d-диастереомеров конфигурация одного хирального центра одинаковая, а другого – противоположная.
Пара сигма диастереомеров. [эритро-форма, трео-форма, (стер9)]
Понятие энантиомерии и d-диастереомерии взаимоисключающие. Если пара стереоизомеров является энантиомерами, то они не будут d-диастереомерами и наоборот.
p–диастереомерия – это вид стереоизомерии, при котором стереоизомеры отличаются друг от друга пространственным расположением одинаковых заместителей относительно плоскости p–связи. Пр.: [бутендиовая к-та, ее цис- и транс-изомеры, (стер10)]
Транс-p-диастереомеры более стабильны и поэтому более распространены в природе. В частности фумаровая кислота является в организме промежуточным продуктом обмена углеводов в анаэробных условиях.
ГЛАВА 3. СТЕРЕОИЗОМЕРИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.
Стереоизомерами(пространственные изомеры) называются соединения, имеющие одинаковый состав и строение, но различающиеся расположением атомов в пространстве.
Конформационные изомеры являются стереоизомерами, различие между которыми вызвано вращением вокруг отдельных участков молекулы вокруг одинарных связей.
Конформации принято изображать в виде пространственных структур или их проекций – проекции Ньюмена.
Конфигурационные изомеры обладают определенным расположением атомов в пространстве, которое не зависит от свободного вращения вокруг одинарной связи.
В соответствии с этим конфигурационные изомеры представляют собой стереоизомеры с различным расположением атомов и групп в пространстве относительно друг друга.
Различают два вида конфигурационной изомерии: геометрическую (цис-, транс-) и оптическую.
СН3 СН3 СН3 Н
С = С С = С
Цис – бутен – 2 Транс – бутен – 2
Оптическая изомерия.
Если атом С соединен с четырьмя различными заместителями, то такой атом называется асимметрическим (хиральный) атомом углерода. Молекулы с асимметрическим атомом углерода называют хиральными. Хиральные молекулы обладают способностью поворачивать плоскость поляризованного света на определенный угол α. Это явление называют оптической активностью, а соответствующие молекулы оптически активными.
Наиболее важным следствием хиральности является существование их в виде пары пространственных изомеров энантиомеров.
Энантиомеры – стереоизомеры, молекулы которых отличаются между собой как предмет и несовместимое с ним зеркальное изображение.
Энантиомеры одинаковы по физическим и химическим свойствам.
Они имеют одинаковые температуры плавления и кипения и отличаются по углу вращения плоскости поляризованного света.
Например: молочная кислота
СН3 – * СН– СООН
асимметрический атом углерода обозначен звездочкой.
Оптические изомеры, вращающие плоскость поляризии вправо называют правовращающими и обозначают знаком «+»,влево- левовращающими и обозначают знаком «-».
D и L символы стереохимической номенклатуры. Знак вращения не имеет прямой связи с конфигурацией. В стереохимических названиях часто D и L заменяются на R и S:
R – правый S – левый
Стереоизомеры, не являющиеся энантиомерами, называются диастереомерами. Это два взаимоисключающие понятия. В отличие от энантиомеров диастериомеры отличаются по физическим и химическим свойствам. Поэтому их можно разделить.
D- Эритроза (I) не является зеркальным изображением стереоизомеров (III) или (IV). Поэтому D-эритроза (I) и D- треоза (III), а также (I) и L-треоза (IV) представляют пары диастереомеров.
Наступает эра стереоизомеров
Картина бельгийского сюрреалиста Рене Магритта « Черное Фальшивое зеркало» как бы говорит нам: на каждый хитрый цитокин найдется свой шпигельмер с левой резьбой.
В коллаже использована оригинальная картина Магритта «Фальшивое зеркало» и рисунок из обсуждаемой статьи [1]
Автор
Редакторы
Недаром зазеркалье манит любителей волшебных историй и ученых. Там скрываются настоящие сокровища — например, зеркальные молекулы, которые можно применять в антицитокиновой терапии, помогающей больным аутоиммунными заболеваниями, но уже на нашей стороне зеркала. Из этой статьи, немного загадочной, вы узнаете о зазеркальных молекулах-шпигельмерах и гомохиральности, а также о роли пущинского кристаллографа в их исследовании.
Как правая и левая рука —
Твоя душа моей душе близка.
Мы смежны, блаженно и тепло,
Как правое и левое крыло.
Но вихрь встает — и бездна пролегла
От правого — до левого крыла!
Марина Цветаева
Эта история для меня началась с того, что мой коллега по Пущинскому научному центру, к.ф.-м.н. Азат Габдулхаков, занимающийся рентгеноструктурным анализом, рассказал об одной своей головоломке. Довелось ему сотрудничать с товарищами из Гамбургского университета для определения пространственной структуры комплекса белка и необычной молекулы РНК [1]. Белок был человеческим цитокином, а РНК создали на основе левой (!) рибозы. Такой комплекс оказался перспективной моделью для получения медицинских препаратов широкого спектра действия.
Меня удивила молекула РНК на основе левой рибозы — это очень эксклюзивная вещь. Какое вообще отношение химические вещества имеют к понятиям лево и право, рассказывает врезка «L- и D-стереоизомеры». К счастью, редко кто из нас задумывается, что природные белки и нуклеиновые кислоты состоят только из левых (L) аминокислот и правых (D) сахаров (см. врезку «Мистическая гомохиральность живого»).
Живые клетки предпочитают употреблять именно такие аминокислоты и сахара, используя их для построения жизненно важных клеточных структур. Белков, построенных только из правых аминокислот, равно как и нуклеиновых кислот, собранных из левых сахаров, в земных организмах не обнаружено. Откуда же взялась левая рибоза? И как такая молекула РНК взаимодействует с человеческим белком? Эти вопросы меня побудили на независимое научное расследование и написание статьи о L- и D-стереоизомерах и прочих интересных вещах.
L- и D-стереоизомеры
Пойдем через века. Вещества с идентичной химической формулой, но при этом по-разному вращающие плоскость поляризованного света, называют стереоизомерами. Обнаружили такие молекулы при изучении винной и виноградной кислот, обладающих одинаковой химической формулой — С4Н6О6 (рис. 1).
В XIX веке, исследуя свойства этих кислот, Луи Пастер понял, почему раствор винной кислоты вращает плоскость поляризации света вправо, а раствор виноградной кислоты оптически не активен [2]. С помощью кристаллов солей виноградной кислоты Пастеру удалось доказать, что она представляет собой не что иное, как смесь двух стереоизомеров винной кислоты.
Рисунок 1. Стереоизомеры
Ученый разделил правовращающую и до той поры неописанную левовращающую винные кислоты. Такие молекулы он назвал изомерами L и D — от латинских слов lævus («левый») и dexter («правый»). Сейчас смесь L- и D-молекул называют рацематом. Получается, что виноградная кислота — это рацемат L- и D- молекул винной кислоты.
Дабы не запутаться во всех этих L и D, естественных и искусственных, я буду молекулы с несвойственной природе хиральностью выделять приставкой «ксено-» (от греч. ξενος, «чуждый»). К примеру, ксенонуклеиновые кислоты [3] образованы L-рибозой. А приставкой «био-» снабжу нуклеиновые кислоты и белки, построенные из преобладающих в живых существах мономеров — D-сахаров и L-аминокислот соответственно.
Мистическая гомохиральность живого
Как левая и правая руки, L- и D-стереоизомеры представляют собой зеркальные отражения друг друга. А поскольку «рука» по-гречески звучит как «хиро» (χειρ), такие молекулы еще называют хиральными. Думаете в равных количествах хиральные молекулы встречаются в природе? Отнюдь.
Биоорганическая химия говорит нам, что природные биополимеры — белки или нуклеиновые кислоты — построены из одинаковых по хиральным свойствам звеньев: L-аминокислот или D-сахаров соответственно. А молекулы с одинаковыми хиральными свойствами называют гомохиральными, от греческого ομος («гомо») — «тот же», «одинаковый». Получается, что наши белки и нуклеиновые кислоты гомохиральны.
Что же с D-аминокислотами и L-сахарами? Существуют ли они в природе? Как оказалось, да. О правых аминокислотах уже не раз писали на «биомолекуле»: например, «D-аминокислоты: не только в зазеркалье» [4]. А вот о левых сахарах известно значительно меньше. В частности, в сыворотке крови млекопитающих найдена фукоза в виде L-изомера, да и она образуется из «обычного» предшественника — правой маннозы [5].
Позволим себе слегка развеять мистический туман, нагнанный автором. Дело в том, что в живых организмах практически все химические реакции протекают под влиянием биокатализаторов — ферментов. Так вот, все ферменты — стереоспецифичные катализаторы, и доходит даже до того, что получение стереоизомеров катализируют два совершенно разных белка, не сходных ни структурно, ни эволюционно. — Ред.
Теперь подробнее о комплексе человеческого белка и ксеноРНК.
Поиск стерео: научный подход
Человеческий цитокин под названием CCL2 служит «тревожным сигналом» для лейкоцитов — белых клеток крови, отвечающих за иммунитет, — и указывает им место, где требуется их вмешательство. В передаче сигнала принимают участие углеводы, называемые гликозаминогликанами. CCL2 воздействует на клетки посредством рецептора CCR2, сопряженного с G-белком, — о таких рецепторах уже немало сказано на «биомолекуле» [8], [9]. При этом цитокин CCL2 передает свой сигнал исключительно рецептору CCR2, но рецептор этот может принимать сигналы и от других цитокинов: CCL8, CCL7 и CCL13 [10]. У здорового человека этот отлаженный механизм обеспечивает активное долголетие: иммунитет работает четко, не доставляя никаких хлопот своему хозяину.
Однако род людской подвержен разным заболеваниям. И сейчас известны такие болезни, в которых повинен чрезмерно активный иммунитет. В частности, интенсивная атака на собственные клетки по непонятным причинам происходит при аутоиммунных заболеваниях, о чем рассказывает статья «Иммунитет: борьба с чужими и. своими» [11]. Сильный иммунитет также мешает при трансплантации органов, заставляя организм отторгать их. В терапии подобных недугов локальный защитник от пагубных нападок иммунитета был бы хорошим помощником. С такими защитниками имеет дело одно из самых современных направлений в медицине — антицитокиновая терапия.
Оказалось, что цитокин CCL2 и рецептор CCR2 играют определенную роль в иммунном ответе. В частности, активация сигнализации по этому пути влияет на течение воспалительных заболеваний, в том числе и аутоиммунных [12]. Поэтому белок CCL2 выбрали в качестве удобной мишени для блокирования этой сигнализации и приступили к поискам блокатора — локального защитника от ненужной активности иммунитета.
Путь поиска блокатора немецкие ученые, коллеги Азата, избрали нестандартный (рис. 2) [13]. Сначала они создали стереоизомер человеческого цитокина CCL2 и подобрали для него специфично связывающийся фрагмент биоРНК, который затем «вывернули наизнанку» — синтезировали его стереоизомер. Итоговый фрагмент ксеноРНК оказался эффективным ингибитором активности биоцитокина CCL2. Не пошла еще голова кругом? У меня — да.
Рисунок 2. Схема эксперимента.
[13], рисунок адаптирован автором
До этого предпринимались попытки найти фрагменты биоРНК или биоДНК, специфически связывающиеся с биоцитокином, и использовать их для блокировки сигнала. Однако нуклеиновые кислоты на основе биосахаров легко распознаются ферментами и, соответственно, склонны к быстрой деградации в организме пациента [14]. Поэтому необычный подход с ксеноРНК дал надежду на успех.
Красивая идея, не правда ли?! Да и неординарность всей работы меня лично восхищает, поэтому далее хочу заострить ваше внимание на наиболее захватывающих моментах научного поиска.
Гомохиральность in cellulo и in vitro
Отмечу, что биосинтез белка возможен только из L-аминокислот, и это один из базовых биохимических процессов [15]. Биотехнологический синтез белка проводят либо непосредственно в клетке (например, в бактерии Escherichia coli), и тогда клеточный аппарат сам синтезирует вам из L-аминокислот столько нужного белка, сколько потребуется, либо в пробирке, для чего составляют специальную биосинтетическую смесь. В ее состав должны входить: 1) матричная РНК, кодирующая аминокислотную последовательность нужного белка; 2) исходный субстрат — левые аминокислоты; 3) энергетики — молекулы АТФ и ГТФ; 4) специально обработанный клеточный экстракт, в котором содержатся рибосомы и вспомогательные молекулы.
Все синтезированные белки будут точной копией друг друга: ошибки в биосинтезе белка — редкое явление. Несомненно, это огромный плюс для исследователей. При некоторой сноровке получение белка таким способом, конечно, занимает определенное время, но сейчас это стандартная задачка, с которой может справиться даже любознательный студент-биолог.
Другое дело — химический синтез белка. Его плюс в том, что в качестве субстрата можно использовать хоть D-, хоть L-аминокислоты, но минус — очень большая трудоемкость при невысокой точности. Поэтому исход процесса зависит от терпения и аккуратности химика-синтетика, то есть человеческий фактор играет значительную роль. Раньше химически синтезировали лишь небольшие пептиды — от двух до десяти аминокислот в цепочке. Сейчас уже можно собрать белок из трехсот и более аминокислот, но до сих пор это нетривиальная задача [16].
В случае с человеческим цитокином CCL2 мишень исследования оказалась в каком-то смысле удачной. Белок состоит всего из 66 аминокислотных остатков, но тем не менее в нём представлены все 20 разных аминокислот. Поэтому для создания ксенобелка исследователям пришлось последовательно, в определенном порядке, химически соединять 20 D-изомеров аминокислот. При этом на каждой стадии контролировать и отделять растущий пептид от молекул, синтезированных с ошибками. Экспериментаторы с этим справились. Далее оставалось лишь надеяться, что ксеноCCL2 сложится в нужную форму.
Сворачивание (фолдинг) белка до сих пор остается фундаментальной научной проблемой [17]. Правда, не буду лукавить, еще в прошлом столетии удалось показать, что, например, химически синтезированная из D-аминокислот ксенопротеаза ВИЧ-1 функционально активна [18]. Отмечу, что именно гомохиральность позволяет молекуле белка создавать функциональную структуру. Поэтому ВИЧ-1-ксенопротеаза специфично расщепляла D-пептиды и имела форму биопротеазы, но зеркально отраженную. Однако природа непредсказуема в своих проявлениях и с одинаковой легкостью рушит или поддерживает теории и хрупкие надежды ученых. С верой в то, что ксеноCCL2 похож на свой биологический стереоизомер, исследователи продолжали экспериментировать, и на следующем этапе использовали метод SELEX (см. врезку «SELEX: создай свой лиганд») для поиска специфично связывающегося фрагмента биоРНК.
В достаточно больших подробностях с представлениями о том, как белковые молекулы обретают свою форму, можно ознакомиться и на «биомолекуле»: «Проблема фолдинга белка» [19]. — Ред.
На работу потратили немало времени и сил, но аптамер из бионуклеотидов нашли. А дальше — стадия трудоемкого химического синтеза ксеноРНК.
SELEX: создай свой лиганд
Метод SELEX — систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) — применяется для генерирования и обнаружения фрагментов биоДНК или биоРНК, специфично взаимодействующих с молекулой-мишенью.
Суть метода такова. С помощью биотехнологий синтезируется огромное количество фрагментов нуклеиновой кислоты (это может быть как ДНК, так и РНК) со случайными последовательностями нуклеотидов. Затем с помощью аффинной хроматографии из библиотеки выбираются те последовательности, которые связываются (по чистой случайности!) с нужной молекулой белка или другой мишенью. На следующем этапе специфический фрагмент нуклеиновой кислоты размножается с помощью полимеразной цепной реакции, если это ДНК, а в случае РНК добавляется стадия обратной транскрипции [20]. Штука тут в том, что размножение происходит с использованием особой «неточной» полимеразы, и библиотека фрагментов получается не идентичной, а содержащей ансамбль олигонуклеотидов, немного отличающихся друг от друга по последовательности. И всё опять проверяется аффинной хроматографией на взаимодействие с нужной молекулой.
Таким образом проводят несколько циклов поиска особенных фрагментов нуклеиновой кислоты. В процессе отбора сродство при связывании олигонуклеотида с целевой молекулой увеличивают. Конечную уникальную последовательность нуклеотидов называют аптамер — от смешения латинского aptus («целесообразный») с греческим meros («часть») [21], [22].
Фрагмент биоРНК, с которым связался ксеноCCL2, состоял из 40 нуклеотидов. Конечно, здесь задача была чуть проще. В молекуле рибонуклеиновой кислоты всего четыре разновидности нуклеозидов: аденозин, гуанозин, уридин и цитидин. С помощью твердофазного синтеза ученые создали все четыре L-рибонуклеозида, а затем получили нужный 40-нуклеотидный ксеноРНК фрагмент [23]. В ходе эксперимента сделали необходимые контроли, и наконец наступил момент истины — связывание с человеческим биобелком CCL2. К всеобщей радости, контакт этих молекул оказался высокоспецифичным: КD = 1,05 нМ [14].
Рентген, проницательный и беспощадный
Однако, чтобы детально понять процесс взаимодействия ксеноРНК и биобелка и воочию подтвердить факт их специфичного связывания, комплекс подвергли рентгеноструктурным исследованиям. На данном этапе подключили российского эксперта. Азат поведал следующее: «Коллегам посчастливилось найти специфический фрагмент L-РНК — это была их большая удача. Они получили кристаллы комплекса цитокина с L-РНК, что тоже невероятное везение. Эту L-РНК, кстати, назвали NOX-E36. Мне нужно было определить структуру и показать с помощью рентгеноструктурного анализа, что человеческий белок CCL2 сохраняет свою природную форму и действительно специфично связывается с NOX-E36. После трудоемких вычислений и длительного поиска нам удалось решить пространственную структуру этого необычного комплекса. Установить, что связывание происходит в месте взаимодействия цитокина с рецептором. Благодаря такому связыванию блокируется сигнал CCL2. Оказалось, что фрагмент ксеноРНК — потенциальный ингибитор и других цитокинов: CCL8, CCL11 и CCL13».
Во время рентгеноструктурного анализа были и свои приключения. Исследователи получили кристаллы в надежде, что это комплекс цитокина с NOX-E36. Поставили кристаллы в пучок рентгеновского луча, собрали дифракционные данные. Задачу решали кристаллографы испытанным методом молекулярного замещения, но решения не находили. Скрупулезная обработка полученных данных результатов не дала, и возникли сомнения. В элементарной ячейке кристалла было что-то, но что именно? Может, просто белок закристаллизовался, а может, это фрагмент ксеноРНК сформировал кристалл? Возможно, в кристалле вообще что-то ненужное!
Тогда решили прибегнуть к другому варианту экспериментов по кристаллизации, с использованием тяжелых атомов. И только с их помощью удалось получить детальную карту электронной плотности, которую должен был расшифровать кристаллограф. Здесь исследователей ждала удача: получилось определить, какие вещества составляли кристалл, и наконец-то найти что-то похожее на РНК. После полного вписывания атомов оказалось, что это и есть ксеноРНК. Обнаружили также дополнительные фрагменты электронной плотности и для белка. Так было доказано реальное существование комплекса биобелка CCL2 с ксеноРНК. Полученная карта электронной плотности отличалась высоким разрешением, а значит, описывала почти все детали молекул и их контакта (рис. 3).
Рисунок 3. Фрагмент карты электронной плотности с аминокислотными остатками и нуклеотидами.
На карте видны нуклеотиды, составляющие NOX-E36, и заметно, что они особенные. Понятно, как аминокислоты формируют α-спирали и β-тяжи в белке. Видны атомы, образующие нуклеотиды и аминокислотные остатки, и ясно, как они взаимодействуют. Однако на этом эксперимент не закончился. Более того, всё самое интересное только начиналось. Теперь на основе полученной структуры проводят анализ — ищут ответы на самые интригующие вопросы: как взаимодействуют ксеноРНК и цитокин, почему блокируется сигнал и как это можно использовать?
КсеноРНК — помощница
Представленная работа — плодотворный союз академической науки и фармацевтической фирмы Noxxon, поэтому параллельно с проверками качества полученного комплекса, ксеноРНК NOX-E36 проходила доклинические испытания на животных, которые оказались успешными. Молекулу сейчас проверяют в схемах иммуносупрессорной терапии, необходимой при трансплантации органов [24], [25]. Уже показана ее эффективность при лечении альбуминурии у людей, больных сахарным диабетом: идет вторая фаза клинических исследований [14], [26].
NOX-E36 — один из представителей шпигельмеров. Так назвали семейство молекул ксеноРНК — от немецкого spiegel, «зеркало» [14]. Разобранная здесь работа — лишь вершина айсберга. В частности, ксеноРНК NOX-A12 испытывают в борьбе с раком: идет вторая фаза клинических исследований, в которых участвуют пациенты с миеломой [27]. Кстати, и ксенопептиды не остаются в стороне. Их синтезируют и тоже тестируют в схемах лечения различных заболеваний [28].
Эра стереоизомеров подкрадывается незаметно. Однако перспективы, которые она открывает, заманчивы. Создание нового класса медицинских препаратов — это только начало. Вероятно, мы не сможем разгадать причину гомохиральности биосферы, но использовать эту особенность природы для нашего глобального прогресса реально уже сегодня.
